Neuroproteomika

Neuroproteomika je studium proteinových komplexů a druhů, které tvoří nervový systém. Tyto proteiny interagují, aby se neurony spojily takovým způsobem, aby vytvořily složitosti, kterými je nervový systém známý. Neuroproteomika je komplexní obor, který má před sebou dlouhou cestu, pokud jde o profilování celého neuronálního proteomu. Je to relativně čerstvý obor, který má mnoho využití v terapii a vědě.
Zatím byly zmapovány pouze malé podskupiny neuronálního proteomu, a to pouze při aplikaci na proteiny zapojené do synapse.

Slovo proteomika bylo poprvé použito v roce 1994 Marcem Wilkinsem jako studie „proteinového ekvivalentu genomu“. Je definováno jako všechny proteiny vyjádřené v biologickém systému za specifických fyziologických podmínek v určitém časovém okamžiku. Může se měnit s jakoukoli biochemickou změnou, a tak může být definováno pouze za určitých podmínek. Neuroproteomika je podmnožinou tohoto oboru zabývající se složitostí a multisystémovým původem neurologických onemocnění. Neurologická funkce je založena na interakcích mnoha proteinů různého původu, a tak vyžaduje systematické studium subsystémů v rámci její proteomické struktury.

Neuroproteomika má obtížný úkol definovat na molekulární úrovni cesty vědomí, smyslů a vlastního já. Neurologické poruchy jsou jedinečné v tom, že ne vždy vykazují vnější příznaky. Definování poruch se stává obtížným a tak je neuroproteomika krokem správným směrem k identifikaci biomarkerů, které mohou být použity k detekci nemocí. Nejen, že obor musí zmapovat různé proteiny, které jsou možné z genomu, ale existuje mnoho modifikací, které se dějí po transkripci a které ovlivňují i funkci. Protože neurony jsou takové dynamické molekuly měnící se s každým akčním potenciálem, který jimi putuje, neuroproteomika nabízí největší potenciál pro zmapování molekulární šablony jejich funkce. Genomika nabízí statickou cestovní mapu buňky, zatímco proteomika může nabídnout pohled do struktur menších než buňka kvůli její specifické povaze ke každému okamžiku v čase.

Aby mohla neuroproteomika správně fungovat, musí být proteiny odděleny podle proteomu, ze kterého pocházejí. Například jedna množina může být za normálních podmínek, zatímco jiná může být za chorobných podmínek. Proteiny jsou běžně odděleny pomocí dvourozměrné polyakrylamidové gelové elektroforézy (2D PAGE). Při této technice jsou proteiny vedeny přes nehybný gel s pH gradientem, dokud se nezastaví v místě, kde je jejich čistý náboj neutrální. Po oddělení nábojem v jednom směru je natrium-dodecylsulfát veden v opačném směru, aby se oddělily proteiny podle velikosti. Pomocí této techniky je vytvořena dvourozměrná mapa, která může být později použita k přiřazení dalších proteinů.
Funkci proteinu lze obvykle přiřadit k identifikaci ve 2D PAGE v jednoduché proteomice, protože je známo mnoho intracelulárních somatických drah. V neuroproteomice se však mnoho proteinů kombinuje a dává konečný výsledek, který může být neurologickým onemocněním nebo rozpadem. Poté je nutné studovat každý protein individuálně a najít korelaci mezi různými proteiny, aby se zjistila příčina neurologického onemocnění. Vyvíjejí se nové techniky, které mohou identifikovat proteiny, jakmile jsou odděleny pomocí 2D PAGE.

Techniky oddělené od proteinů, jako je 2D PAGE, jsou omezené v tom, že nezvládají proteinové druhy s velmi vysokou nebo nízkou molekulovou hmotností. Pro řešení takových případů byly vyvinuty alternativní metody. Patří mezi ně kapalinová chromatografie hmotnostní spektrometrie spolu s elektroforézou natrium-dodecyl-sulfátu polyakrylamidového gelu nebo kapalinová chromatografie hmotnostní spektrometrie provozovaná ve více dimenzích. Oproti jednoduché 2D stránce dokáže kapalinová chromatografie hmotnostní spektrometrie zvládnout větší rozsah proteinových druhů, ale je omezená v množství proteinového vzorku, který zpracuje najednou. Kapalinová chromatografie hmotnostní spektrometrie je také omezená v tom, že nemá referenční mapu, se kterou by mohla pracovat. Složité algoritmy se obvykle používají k analýze okrajových výsledků, které se objevují po provedení procedury. Neznámé části proteinových druhů se však obvykle neanalyzují ve prospěch známých proteomů. Tato skutečnost odhaluje chybu současné technologie; je zapotřebí nových technik, aby se zvýšila specifičnost i rozsah mapování proteomů.

Je obecně známo, že drogová závislost zahrnuje permanentní synaptickou plasticitu různých neuronálních obvodů. Neuroproteomika je aplikována ke studiu účinku drogové závislosti napříč synapsí. Výzkum je prováděn izolováním odlišných oblastí mozku, ve kterých dochází k synaptickému přenosu a definováním proteomu pro tuto konkrétní oblast. Různá stádia drogové závislosti však musí být studována, aby bylo možné zmapovat progresi proteinových změn v průběhu drogové závislosti. Tato stádia zahrnují lákání, požití, abstinenci, závislost a odstranění. Začíná změnou v genomu prostřednictvím transkripce, ke které dochází v důsledku zneužívání drog. Pokračuje v identifikaci nejpravděpodobnějších proteinů, které budou drogami ovlivněny a zaměřuje se na tuto oblast.
U drogové závislosti je nejpravděpodobnějším cílem synapse, protože zahrnuje komunikaci mezi neurony. Nedostatečná smyslová komunikace v neuronech je často vnějším znakem zneužívání drog, a tak je aplikována neuroproteomika, aby se zjistilo, jaké proteiny jsou ovlivněny, aby se zabránilo transportu neurotransmiterů. Zejména je studován proces uvolňování váčků, aby se identifikovaly proteiny zapojené do synapse během zneužívání drog. Proteiny jako synaptotagmin a synaptobrevin interagují a spojují váček s membránou. Fosforylace má také vlastní sadu zapojených proteinů, které pracují společně, aby synapse správně fungovala. Léky jako morfin mění vlastnosti, jako je buněčná adheze, objem neurotransmiterů a synaptický provoz. Po významné aplikaci morfinu dostávaly tyrosinkinázy méně fosforylace, a tak vysílají méně signálů uvnitř buňky. Tyto receptorové proteiny nejsou schopny iniciovat intracelulární signalizační procesy, které umožňují neuronu žít, a nekróza nebo apoptóza mohou být výsledkem. S rostoucím počtem neuronů ovlivněných v tomto řetězci buněčné smrti může být výsledkem trvalá ztráta smyslových nebo motorických funkcí. Identifikací proteinů, které se mění v důsledku zneužívání léků, může neuroproteomika poskytnout klinikům ještě dřívější biomarkery k testování, aby se předešlo trvalému neurologickému poškození.

Nedávno byla vytvořena nová terminologie (Psychoproteomika) výzkumníky z University of Florida z Dr. Mark S Gold Lab. Kobeissy et al. definovali Psychoproteomiku jako integrální proteomický přístup věnovaný studiu proteomických změn v oblasti psychiatrických poruch, zejména neurotoxicity vyvolané zneužíváním látek a drog.

Traumatické poranění mozku je definováno jako „přímý fyzický náraz nebo trauma do
hlavy následované dynamickou sérií poranění a oprav“. Nedávno byla neuroproteomika aplikována při studiu postižení, se kterým žije přes 5,4 milionu Američanů. Kromě fyzického poranění mozkové tkáně traumatické poranění mozku indukuje uvolnění glutamátu, který interaguje s ionotropními glutamátovými receptory (iGluR). Tyto glutamátové receptory okyselují okolní intrakraniální tekutinu a způsobují další poranění blízkých neuronů na molekulární úrovni. Smrt okolních neuronů je vyvolána normálními mechanismy apoptózy a právě tento cyklus je studován s neuroproteomikou. Na apoptotické dráze indukované kyselým prostředím spouštěným glutamátem se podílejí tři různé deriváty cysteinové proteázy. Tyto cysteinové proteázy zahrnují calpain, caspase a cathepsin. Tyto tři proteiny jsou příklady zjistitelných příznaků traumatického poranění mozku, které jsou mnohem specifičtější než teplota, hladina kyslíku nebo intrakraniální tlak.
Proteomika tak také nabízí sledovací mechanismus, pomocí kterého mohou výzkumníci sledovat progresi traumatického poranění mozku nebo chronického onemocnění, jako je Alzheimerova nebo Parkinsonova choroba. Zejména u Parkinsonovy choroby, ve které hrají velkou roli neurotransmitery, zahrnoval nedávný proteomický výzkum studium synaptotagminu. Synaptotagmin se podílí na vápníkem indukovaném bujení váčku obsahujícího neurotransmitery z presynaptické membrány. Studiem intracelulárních mechanismů podílejících se na nervové apoptóze po traumatickém poranění mozku mohou výzkumníci vytvořit mapu, kterou mohou později sledovat genetické změny.

Jedna skupina výzkumníků aplikovala pole neuroproteomiky, aby zkoumala, jak různé proteiny ovlivňují počáteční růst neuritidy . Experiment porovnával proteinovou aktivitu kontrolních neuronů s aktivitou neuronů léčených nervovým růstovým faktorem (NGF) a JNJ460, „imunofilním ligandem“. JNJ460 je potomek jiného léku, který se používá k prevenci imunitního útoku při transplantaci orgánů. Není to však imunosupresivum, ale spíše působí jako štít proti mikrogliím. NGF podporuje životaschopnost a diferenciaci neuronů vazbou na TrkA, tyrozinovou receptorovou kinázu. Tento receptor je důležitý při iniciaci intracelulárních metabolických drah, včetně Ras, Rak a MAP kinázy.

Diferenciace bílkovin byla měřena v každém buněčném vzorku s ošetřením NGF a JNJ460 i bez něj. Směs peptidů vznikla odplavením volných částí sekvence aminokyselin v reverzní koloně. Výsledná směs byla poté suspendována ve směsi peptidů v lázni kationtové výměnné kapaliny. Bílkoviny byly identifikovány spojením s trypsinem a následným hledáním výsledků průchodu produktu hmotnostním spektrometrem. To se provádí formou kapalinové chromatografie hmotnostní spektrometrií k identifikaci bílkovin ve směsi.

Léčba JNJ460 měla za následek zvýšení „signálních transdukčních“ proteinů, zatímco NGF měla za následek zvýšení proteinů spojených s ribozomem a syntézou jiných proteinů. JNJ460 také měla za následek více strukturních proteinů spojených s mezibuněčným růstem, jako je aktin, myosin a troponin. S léčbou NGF buňky zvýšily syntézu proteinů a tvorbu ribozomů. Tato metoda umožňuje analýzu všech proteinových vzorců celkově, spíše než jedinou změnu aminokyseliny. Západní skvrny podle výzkumníků potvrdily výsledky, i když změny v proteinech nebyly v jejich protokolu tak zřejmé.

Hlavním významem těchto zjištění je, že JNJ460 jsou NGF jsou odlišné procesy, které oba kontrolují proteinový výstup buňky. JNJ460 měla za následek zvýšenou velikost a stabilitu neuronů, zatímco NGF měla za následek zvýšení membránových proteinů. Když se spojí dohromady, významně zvyšují šanci neuronu na růst. I když JNJ460 může „připravit“ některé části buňky pro léčbu NGF, nespolupracují. Má se za to, že JNJ460 interaguje se Schwannovými buňkami při regeneraci aktinu a myosinu, které jsou klíčovými hráči v axonálním růstu. NGF pomáhá neuronu růst jako celku. Tyto dva proteiny však nehrají roli v komunikaci s ostatními neurony. Pouze zvětšují velikost membrány, dolů kterou může být vyslán signál. Jiné proteomy neurotrofického faktoru jsou potřebné k navádění neuronů k sobě, aby se vytvořily synapse.

Široký záběr dostupných surových neuronálních proteinů k mapování vyžaduje, aby se úvodní studie zaměřily na malé oblasti neuronů. Při odebírání vzorků existuje několik míst, která neurology zajímají nejvíce. Nejdůležitějším místem, kde začít, je pro neurology plazmatická membrána. Tam probíhá většina komunikace mezi neurony. Mezi proteiny, které jsou zde mapovány, patří iontové kanály, receptory neurotransmiterů a molekulové transportéry. Podél plazmatické membrány se studují proteiny podílející se na vytváření lipidových raftů bohatých na cholesterol, protože se ukázalo, že jsou klíčové pro vychytávání glutamátu v počátečních fázích tvorby neuronů. Jak již bylo zmíněno, vezikulární proteiny jsou také studovány podrobně, protože se podílejí na onemocnění.
Sběr vzorků ke studiu však vyžaduje zvláštní pozornost, aby se zajistilo, že reprodukovatelnost vzorků nebude ohrožena. Když se odebírá například globální vzorek jedné oblasti mozku, bílkoviny, které jsou všudypřítomné a relativně nedůležité, se v SDS PAGE projevují velmi jasně. Jiné neprobádané, specifičtější bílkoviny se téměř neobjevují, a jsou proto ignorovány. Obvykle je nutné rozdělit proteom plazmatické membrány například na subproteomy charakterizované specifickou funkcí. To umožňuje, aby se tyto specifičtější třídy peptidů ukázaly zřetelněji. Rozdělení na subproteomy je svým způsobem pouhým nasazením zvětšovací čočky na specifický úsek mapy SDS PAGE globálního proteomu. Tato metoda se zdá být nejúčinnější, když se aplikuje na každou buněčnou organelu zvlášť. Například mitochondriální bílkoviny, které jsou účinnější při transportu elektronů přes jeho membránu, mohou být cíleně cíleny tak, aby se jejich schopnost transportu elektronů vyrovnala jejich sekvenci aminokyselin.